第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周。

　　1、技术原理

　　Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。它的主要测序原理如下图 abc所示。

　　(1)DNA文库制备

　　利用超声或者氮气喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同接头分A、B两种，即各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp (TCAG)的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素(Biotin)标记，用于磁珠纯化步骤。待测DNA进行 PCR扩增，并构建单链DNA文库(图1.a)。

　　(2)emPCR(乳液PCR)

　　454测序的一个关键步骤，将富集到的文库与直径约28um的测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水(water-in-oil)的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器中将只包含一个磁珠和一条单链DNA,通过控制该步骤的条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。经过PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段依然结合在磁珠上。(图1.b)

　　(3)焦磷酸测序

　　454测序的反应板称为PTP，这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，以便检测接下来的测序反应过程。

　　测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团，并发出荧光，每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同。同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，通过光信号处理而获得最终的测序结果。

　　图1. Roche 454测序系统原理[1]

　　由于454测序技术中，每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。454技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长，当前454技术的平均读长可达400bp，并且其准确性仍能达到99%以上;但它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度，如当序列中存在类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得，这就有可能导致结果不准确。

　　2、代表厂家及仪器特点

　　454 生命科学公司于2005年推出的GS20测序仪，是第一个商品化的NGS平台，具有里程碑式的意义。同年获得华尔街生物技术医药类的创新金奖。

　　2007年，罗氏诊断(Roche Diagnostics)以1.55亿美元收购了454，并推出了一系列性能更优的NGS系统，极大的提升测序通量和准确性，也进一步增加了测序读长。虽然罗氏454具有读长优势，由于在454测序系统在通量、准确性、以及成本等方面缺乏竞争力，因此罗氏在2016年底终止了454 NGS测序相关的业务。