生物药cdmoPCR反应前准备及操作步骤-产品百科-seo学途外链网

生物药cdmoPCR反应前准备及操作步骤

版块：产品百科类型：普通作者：ningxueqin 查看：111 回复：0 获赞：0 时间：2023-11-21 22:51:41

　生物药cdmo聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。
　　PCR反应前准备工作：
　　PCR反应开始前，你需要准备好DNA模板（基因组DNA或者反转录制备的cDNA）,特异性的引物（手动设计或利用软件设计）并选择合适的商业化DNA聚合酶（根据实验的目的不同做出决定）。
　　1. DNA聚合酶的选择
　　市面上有多种DNA聚合酶可供选择，他们的特性也各有不同。因此你需要选择最适合自己实验需要的产品。通常我们将DNA聚合酶分为高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到没有任何突变的PCR产物，那应当选择高保真聚合酶。若你只是希望判断特异性序列的存在与否，那普通的Taq聚合酶已经足够。另外要注意的一点是，进行T载体连接的时候，要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有A末端的，因此你在T载体连接之前需要进行加A反应。或者直接选用普通的Taq聚合酶。
　　2. 引物
　　引物特异性会影响到PCR反应成功的可能性，好的引物设计对PCR成功至关重要。设计引物时，有以下几条原则需要谨慎考虑：
　　1）. 引物长度
　　通常PCR引物长度在18-22个碱基之间。这对引物的特异性以及退火温度而言均已足够。
　　2）. 解链温度Tm
　　Tm值的定义是使得一半双链DNA解螺旋成为单链DNA的温度。引物的Tm值通常要在52-58度之间。
　　3）. GC含量
　　最适合的GC含量为40-60%。
　　就目前而言很多软件都可以用来设计引物，如primer5和Oligo。通常这些软件设计得到的引物均可以满足需要。
　　二、操作步骤：
　　准备好各种试剂和PCR仪，就可以开始PCR实验：将各种试剂混合并按照说明书设置PCR反应。一般PCR循环如下：
　　1. 起始步骤：
　　这对于热启动PCR而言是必须的，将反应混合液加热至94-98度以激活DNA聚合酶。这一步的时间取决于所选用的DNA聚合酶。
　　2. 变性步骤：
　　DNA本身是双链结构，而DNA扩增需要引物与单链DNA模板相结合。在这一步，反应混合液被加热至94-98度保持20-30秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链DNA。这是PCR循环中的第一步。
　　3. 退火步骤：
　　变性之后，DNA模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与DNA模板互补，当反应温度降至50-65度时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度。这一步通常维持20-40秒，而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始DNA合成。
　　4. 延伸步骤：
　　在这一步，DNA聚合酶开始DNA合成，因此这一步的温度选取的是DNA聚合酶的最优温度。通常我们选用72度，但某些DNA聚合酶的最适温度是68度。这一步与体内的DNA复制很相似：DNA聚合酶按照碱基互补规律将dNTPs加到引物的3’末端最终得到新的DNA双链片段。延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能够合成1kb长度的DNA。
　　5. 第2步至第4步称为一个循环：
　　每次循环之后DNA的量均是前一次的两倍。通常一次PCR反应进行30-35个循环。在前几轮的PCR循环过程中PCR产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着dNTPs和引物的量的减少以及DNA聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此PCR反应的产量也受到了限制。
　　6. 最后的延伸步骤：
　　当30-35个循环结束后，我们通常会以68-74度延伸5-10分钟，这是希望使反应体系中残留的单链DNA全部反应完毕。
　　7. 维持时间：通常我们设置4-10度为反应后PCR产物的保存温度。

点我在下方展示

91624 91623 91622 91621 91620 91619 91618 91617 91616 91615

回复列表

默认热门正序倒序

首 1 尾

暂无用户组

退出

等级：0级

学途币：

游客：

后台控制面板

平台声明：

为打造一个高质量、高收录的外链平台，站长将针对所有普通用户投稿的内容进行审核，针对文章原创度、文章格式是否杂乱、外链数量是否泛滥等多个方面对投稿内容进行审核测评，只有满足条件的内容才会通过审核。

平台将持续严厉打击发布虚假不实信息内容，一经发现立即删除，且将对发布虚假内容的账号进行相应的处罚。