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亲和力测定服务引起WB实验背景过高的因素
版块:产品百科   类型:普通   作者:ningxueqin   查看:93   回复:0   获赞:0   时间:2023-11-24 22:43:12
 亲和力测定服务引起WB实验背景过高的因素:
  应该是多因素引起的:封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。
  1、封闭不完全:一抗或二抗只要结合到膜上,就会显色。为了避免非特异性的结合,应用封闭液孵育膜,使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐的封闭液是3%的明胶。在室温孵育1小时。明胶不能再4℃孵育,因为会凝结。如果想在低温封闭的话,可以用3%的BSA 。PVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。脱脂奶粉不能与Bio-Rad生物素化的蛋白标准一起使用。脱脂奶粉浓度过高也可能会产生背景!
  2、显色过度:显色时间的长短取决于蛋白条带的数目以及你想要的灵敏度。如果膜在显色液中放置太久,背景就会偏高。应当在蛋白条带清晰课件,而背景几乎没有货很少时,将膜及时取出。
  3、转移缓冲液或设备污染:使用清洁剂将转印槽内外彻底清洗干净。海绵垫也一定要认真清洗。脏的海绵垫通常是污染的最主要原因。另外 ,每次转膜时的缓冲液都要是新鲜配制的。
  4、抗体稀释度不正确:一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定。一般来说,以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清,以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。抗体稀释度不够,会产生非特异性的结合,带来高背景。
  5、二抗不纯:没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用,产生杂带。

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